干货|一文读懂外泌体miRNA检测如何选择内参
在进行细胞、血液、组织miRNA检测时，我们常选择U6做内参基因。U6属于细胞内有核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)，是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分，长度约为100-215个核苷酸，参与mRNA前体的加工过程。U6稳定、含量丰富、高度保守、在真核细胞内都普遍存在。那么问题来了，在外泌体miRNA检测时U6是否可以作为内参基因呢？
外泌体是由细胞内多泡体被细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约30-150nm的膜性囊泡，主要成分为蛋白质、酶、mRNA、miRNA、DNA片段和脂质等，其中miRNA是外泌体主要核酸成分，目前已经成为诸多疾病诊断的潜在标志物。但是在临床样品检测过程中，外泌体miRNA检测至今还没有一个公认的内参基因。
已发表的文章中选择什么内参基因做外泌体miRNA检测的呢？这里小编对外泌体miRNA检测中用到的内参基因做了整理。
表1：通过系统性的算法分析出来的内参基因
表2：实验中具体使用的内参基因
为了方便大家在后期实验中选择外泌体miRNA检测的内参基因，我们针对文献中的信息做了归类统计，根据样品种类和基因频率总结如下：
细胞上清液
内参 | 出现频率 |
mi-16 | 1 |
snRNA u6 | 1 |
let-7a | 1 |
尿液
内参 | 出现频率 |
hy3 | 1 |
snRNA U48 | 1 |
snRNA u6 | 1 |
miR-16 | 1 |
miR-320 | 1 |
血浆
内参 | 出现频率 |
miR-126 | 1 |
miR-145 | 1 |
miR-28-3p | 1 |
miR-30a-5p | 1 |
miR-30e-5p | 1 |
血清
内参 | 出现频率 | 内参 | 出现频率 |
mir-221 | 3 | snRNA u6 | 4 |
mir-103 | 2 | mi-16 | 1 |
let-7a | 4 | hy3 | 2 |
mir-26a | 3 | snRNA U48 | 2 |
mir-191 | 1 | miR-181c | 1 |
mir-181a | 2 | miR-451 | 1 |
那么实验中到底该如何选择外泌体miRNA检测的内参基因呢？遗憾的是，目前没有标准答案。但是基于宇玫博生物实验室实际的检测情况，建议大家在检测过程中，设置两个内参基因，优先选择已经有文献支持的内参基因。在结果分析的时候，以系统中最稳定的内参基因来做数据分析，这样获得的结果可靠性更高一些。 如有更多外泌体相关技术问题，可以直接和宇玫博生物的技术专家高博士进行交流。
参考文献：
1. 2015 Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis.
2. 2015 Assessment of endogenous reference gene suitability for serum exosomal miRNA expression analysis in liver carcinoma resection studies.
3. 2015 Identification of Endogenous Controls for Analyzing Serum Exosomal miRNA in Patients with hepatitis B or hepatocellular carcinoma.
4. 2016 Evaluation of optimal extracellular vesicle small RNA isolation and qRT-PCR normalisation for serum and urine.
5. 2016 The choice of endogenous controls in exosomal miRNA assessments from biofluids.
6. 2017 Identification of miR-16 as an endogenous reference gene for the normalization of urinary exosomal miRNA expression data from CKD patients.
7. 2017 miRNAs and Reference Gene Methodology.
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