反向捕获法高效灵敏地检测血清外泌体中的N-糖基化蛋白

糖基化是人类蛋白质最普遍的一种翻译后修饰(PTM)，在多种疾病中均可观察到糖基化水平的变化，而糖基化的改变被认为是不同类型癌症的标志。外泌体是细胞释放的囊泡(直径通常在30-100 nm)，广泛存在于体液中，其包膜表面携带大量的糖蛋白和糖脂，外泌体内的糖基化水平可能成为一种潜在的疾病标志物，目前对外泌体的N-糖基化修饰研究较少。近日，来自复旦大学Ying Zhang 和 Haojie Lu教授的研究成果，通过反向捕获法高效灵敏地检测血清外泌体中的N-糖基化蛋白，首次报道了人血清外泌体中的N-糖基化蛋白可能成为潜在的疾病标志物，该成果发表在Chemical Communications (IF=6.12)上。

质谱作为分析N-糖基化最有力的工具，现已用于多种疾病的血清或血浆中鉴定N-糖基化修饰。但由于外泌体的微量，N-糖基化的高亲水性及其它高丰度杂质的信号干扰等原因，使我们对血液外泌体N-糖基化的认知仍然缺乏。本研究通过逆向捕获策略提取了人血清外泌体中N-糖基化的蛋白。同时，本研究还系统地评估了该策略，包括结合效率、样品与树脂的比例、富集能力、选择性和灵敏度。

首先，使用标准肽来检测肽和树脂的结合效率。结果表明结合效率接近100%。然后，研究了样品装填量与树脂的比例和结合能力，并确定树脂结合多肽的能力为0.75μg /μL。此外，研究了该方法的选择性，并将其与商业上可用的纯化材料进行了比较。结果表明，与HILIC(亲水作用色谱)相比，反向捕获具有更好的选择性。最后，为了评估反向捕获方案的敏感性，通过测定分析了一系列不同浓度的卵白蛋白（OVA）溶液中的N-聚糖。结果表明，与传统方法相比反向捕获策略具有更好的灵敏度。

该研究中使用这种反相捕获策略来分析人血清外泌体的N-糖基化。通过Umibio血液外泌体提取试剂盒从健康人和肝细胞癌(HCC)患者血清中分离得到外泌体，通过电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和western blot对其进行了鉴定，证实了外泌体的成功分离。提取出来的外泌体被裂解提取蛋白质，在反向捕获策略富集后用Lys C和胰蛋白酶进行裂解。通过MALDI质谱检测，最终分别在HCC患者样本和健康对照外泌体样本中检测到77个N-聚糖和74个N-聚糖。通过对检测到的N-聚糖类型强度值的进一步分析发现，与健康组相比，HCC组有24个N-聚糖丰度上调。其中近90%为复杂型N-聚糖，一半以上含有岩藻糖或唾液酸。

此外，还利用该方法研究分析了HCC组和健康组血清中N-聚糖的表达情况。结果表明，与健康组比较，HCC组中有29个N-聚糖丰度上调。其中大部分为复杂型，含有唾液酸和核心岩藻糖。比较分析外泌体中N-聚糖的变化情况与血清中N-聚糖的变化情况，发现有11个N-聚糖丰度在二者中均上调，而13个N-聚糖只在外泌体中上调表达。与血清中上调的29个N-聚糖相比，外泌体中的N-聚糖含唾液酸或岩芯岩藻糖的比例较高。与之前报道中细胞系外泌体的聚糖变化规律相符合。

综上，该研究主要是优化了一种分析外泌体N-聚糖的方法。利用这种方法，该报道首次从人血清中发现了外泌体的N-聚糖。并分别从HCC组和健康组的外泌体中检测到77和74个N-聚糖。该结果可能为HCC潜在标志物的研究提供新的思路，并为进一步研究血清外泌体的N-糖基化奠定基础。