胰腺癌细胞外囊泡的单分子特征研究

2020-02-24

胰腺导管腺癌(PDAC)的症状是非特异性,患者通常在晚期才被确诊,然而目前缺少有效的早期筛查手段。细胞外囊泡(EVs) 是很好的生物标志物,无论健康细胞还是病变细胞,都会不断产生EVs。健康细胞分泌的EVs包含参与正常细胞间通讯的分子调控因子,而癌细胞脱落的EVs则在疾病的发病过程中发挥作用,如肿瘤的发生、发展等。


通过细胞外囊泡(EVs)进行液体活检时,目前主要有两个挑战,一是如何从特定细胞类型中分离EV,二是如何在单个EV水平上表征整个EV亚群。在此,我们采用了单分子定量显微定位技术(qSMLM),它是一种灵敏的基于荧光的成像方法,其单分子灵敏度可达10 nm左右,该方法可被用来全面评估细胞培养和患者血浆中来源的EVs,该方法有望成为诊断特定EV群体的有效手段。

 

方法与结果


1. EVs分离及利用蛋白质组学评估其重复性


采用大小排阻层析法(SEC)分离PANC的EVs。分别用纳米颗粒跟踪分析EV浓度(图1(a),浅灰色),用NanoDrop分析蛋白浓度(图1(a),深色),通过Western blots检测EV组分中EGFR和EV标记(CD63和TSG101)的数量(图1(a),顶部)。SEC分数8 (F8)代表最高的EVs数量。因此,我们通过LC-MS/MS分析L了三种独立制备的EV样本中F8的重现性。每个重复中鉴定的蛋白质的数量在180-193个之间,其中95%以上的蛋白在ExoCarta中注释,超过95%的蛋白质在三个复制中共有。现蛋白质组学质谱数据已通过PRIDE共享(数据集标识符为PXD012660)存储下到ProteomeXchange平台。


2. 利用qSMLM技术对细胞系来源的EVs特性进行观察


qSMLM技术使用荧光标记探针,对EVs进行检测,其定量结果为相对定量并非绝对定。该研究评估了来自SEC F8的PAN C-1 EVs。用西妥昔单抗免疫捕获表皮生长因子受体(EGFR)(图1(b),左),通过SMLM成像确定EVs经AF647染色后图像(图1(b)(右侧))。同时测定EV大小(图1(c))并通过透射电子显微镜进行验证(图1(d),右侧)。偶联AF647的西妥昔单抗可以检测EV中EGFR的含量,如图2(a)所示。每个黑点代表一个EV。且该方法检测到的EV数量在较宽范围内与孵育添加的EV数量正相关(图2(b))。该实验并通过添加Triton-X 100破坏细胞膜(图2(c))来验证该富集方法;该实验选择CA19-9抗体对EV进行富集,发现与健康人群相比,PANC样本中含量更高(图2(e,f))。


3.RNA seq


为了进一步评估EV的含量,本研究从PANC和HPDEC细胞的SEC F7-9中分离出RNA,并使用Ribogreen进行定量。PANC的RNA含量较高,F8的RNA含量在两个细胞系中均较高。所有样本的测序深度相似。来自PANC细胞的F8 EVs在所有三个复制中检测到的转录本数量最多。最后找到3227个差异表达基因。

注:原始序列数据可以在exRNA图谱上找到(exRNA -atlas.org,登录号:EXR-KJENS1PANCANC1-AN)


4. 利用qSMLM技术对血浆来源的EVs特性进行观察


分别用西妥昔单抗-AF647和 CA19-9 Ab- AF647进行亲和分离(图3(a-c)。与健康受试者相比,从PDAC患者中分离出的EV明显更多,使用EGFR和CA19-9富集后EV的数量分别增加了5倍和15倍。PDAC患者血浆EVs分布复杂、不均匀。本研究控制受检人群中与PDAC相关的人群不超过健康受试者的5% (灰色多边形,图3(c))。每个EV内包含的EGFR和CA19-9的平均数量分别增加了35倍和130倍(图3(d))。

 

结    论


qSMLM结果与临床数据的比较表明,该研究的整体方法可灵敏有效地检测PDAC,具有诊断潜力。

 

研究亮点


利用qMLM技术实现单个囊泡水平上对PDAC进行诊断。同时利用蛋白质组学技术,评估该技术的重复性。