胰腺癌细胞外囊泡的单分子特征研究

胰腺导管腺癌(PDAC)的症状是非特异性，患者通常在晚期才被确诊，然而目前缺少有效的早期筛查手段。细胞外囊泡(EVs) 是很好的生物标志物，无论健康细胞还是病变细胞，都会不断产生EVs。健康细胞分泌的EVs包含参与正常细胞间通讯的分子调控因子，而癌细胞脱落的EVs则在疾病的发病过程中发挥作用，如肿瘤的发生、发展等。

通过细胞外囊泡(EVs)进行液体活检时，目前主要有两个挑战，一是如何从特定细胞类型中分离EV，二是如何在单个EV水平上表征整个EV亚群。在此，我们采用了单分子定量显微定位技术(qSMLM)，它是一种灵敏的基于荧光的成像方法，其单分子灵敏度可达10 nm左右，该方法可被用来全面评估细胞培养和患者血浆中来源的EVs，该方法有望成为诊断特定EV群体的有效手段。

方法与结果

1. EVs分离及利用蛋白质组学评估其重复性

采用大小排阻层析法(SEC)分离PANC的EVs。分别用纳米颗粒跟踪分析EV浓度(图1(a)，浅灰色)，用NanoDrop分析蛋白浓度(图1(a)，深色)，通过Western blots检测EV组分中EGFR和EV标记(CD63和TSG101)的数量(图1(a)，顶部)。SEC分数8 (F8)代表最高的EVs数量。因此，我们通过LC-MS/MS分析L了三种独立制备的EV样本中F8的重现性。每个重复中鉴定的蛋白质的数量在180-193个之间，其中95%以上的蛋白在ExoCarta中注释，超过95%的蛋白质在三个复制中共有。现蛋白质组学质谱数据已通过PRIDE共享(数据集标识符为PXD012660)存储下到ProteomeXchange平台。

2. 利用qSMLM技术对细胞系来源的EVs特性进行观察

qSMLM技术使用荧光标记探针，对EVs进行检测，其定量结果为相对定量并非绝对定。该研究评估了来自SEC F8的PAN C-1 EVs。用西妥昔单抗免疫捕获表皮生长因子受体（EGFR）（图1(b)，左），通过SMLM成像确定EVs经AF647染色后图像（图1(b)(右侧)）。同时测定EV大小(图1(c))并通过透射电子显微镜进行验证(图1(d)，右侧)。偶联AF647的西妥昔单抗可以检测EV中EGFR的含量，如图2(a)所示。每个黑点代表一个EV。且该方法检测到的EV数量在较宽范围内与孵育添加的EV数量正相关（图2(b)）。该实验并通过添加Triton-X 100破坏细胞膜（图2(c)）来验证该富集方法；该实验选择CA19-9抗体对EV进行富集，发现与健康人群相比，PANC样本中含量更高（图2(e,f)）。

3.RNA seq

为了进一步评估EV的含量，本研究从PANC和HPDEC细胞的SEC F7-9中分离出RNA，并使用Ribogreen进行定量。PANC的RNA含量较高，F8的RNA含量在两个细胞系中均较高。所有样本的测序深度相似。来自PANC细胞的F8 EVs在所有三个复制中检测到的转录本数量最多。最后找到3227个差异表达基因。

注：原始序列数据可以在exRNA图谱上找到(exRNA -atlas.org，登录号:EXR-KJENS1PANCANC1-AN)

4. 利用qSMLM技术对血浆来源的EVs特性进行观察

分别用西妥昔单抗-AF647和 CA19-9 Ab- AF647进行亲和分离(图3(a-c)。与健康受试者相比，从PDAC患者中分离出的EV明显更多，使用EGFR和CA19-9富集后EV的数量分别增加了5倍和15倍。PDAC患者血浆EVs分布复杂、不均匀。本研究控制受检人群中与PDAC相关的人群不超过健康受试者的5% (灰色多边形，图3(c))。每个EV内包含的EGFR和CA19-9的平均数量分别增加了35倍和130倍(图3(d))。

结    论

qSMLM结果与临床数据的比较表明，该研究的整体方法可灵敏有效地检测PDAC，具有诊断潜力。

研究亮点

利用qMLM技术实现单个囊泡水平上对PDAC进行诊断。同时利用蛋白质组学技术，评估该技术的重复性。