冻干技术在外泌体存储中的应用
一、什么是外泌体？
外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种，大小在30-150nm，由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。
二、外泌体的常规存储条件有哪些？
实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一项研究中[1] ，研究者评估了储存在4℃，-20℃和-80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。研究者发现，与新鲜分离的外泌体相比，不同的存储温度和存储时间会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量（Fig.1），并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布（Fig.2）。对于功能性研究，根据研究设计建议对新鲜分离的外泌体进行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是对于长期保存用于治疗应用的外泌体，-80℃存储条件将是更可取的。
外泌体作为治疗试剂或药物递送载体有广泛的应用前景，但外泌体存储在-80°C将不利于其运输及应用，因此还需要其他存储方法。冻干是一种已用于保存多种类型的生物材料（蛋白质，血浆、活细胞等）的技术。此外，冻干技术已被用于改善药物递送载体脂质体的长期稳定性。因此，冻干技术有可能改善外泌体的保存稳定性，如果冻干的外泌体可以在室温条件下稳定保存，外泌体的应用范围则将会大大提升。
Fig.1 不同存储条件和不同存储时间下外泌体的NTA检测结果
Fig.2 不同储存条件下外泌体的细胞吸收
三、冻干技术在外泌体存储中的尝试
2016年Johnny等人从胶质瘤患者脑脊液中分离的外泌体，溶解于PBS缓冲液后进行冻干，外泌体冻干粉在室温中存放了7天后，发现外泌体颗粒数减少了37–43% [2] ；2018年Elia等人在间充质干细胞外泌体中试生产中使用了冻干技术，并针对冻干的外泌体进行了理化检测[3] ；2018年Chonlada等人通过海藻糖作为冻存保护剂进行黑色素瘤外泌体冻干，在25℃条件下可以稳定保存4周时间[4]. 2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）作为干细胞外泌体的冻存保护剂，摸索两者之间的不同比例来寻找合适的保护剂[7] ；
四、外泌体常用的冻存保护剂有哪些？
4.1 海藻糖 trehalose
海藻糖是蘑菇、虾、昆虫和细菌中所含的一种天然的非还原性的二糖。海藻糖被食品和化妆品工业广泛用作构造剂，稳定剂或保湿剂，并用作不稳定蛋白药物，疫苗和脂质体以及用于移植的细胞和器官的（低温）防腐剂。多项毒性研究确定了口服，胃或肠胃外给药后海藻糖在小鼠和人类中的安全性和耐受性。海藻糖为多种生物物质提供保护作用，包括稳定蛋白质，细胞膜和脂质体，减少冷冻过程中细胞内冰形成以及防止蛋白质聚集的能力[4，5, 7] 。
4.2 甘露醇mannitol
化学式为C6H14O6，是一种糖醇，是山梨糖醇的同分异构体，易溶于水，为白色结晶性粉末，有类似蔗糖的甜味，常用的冻存保护剂。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性。通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集，但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集[3，6] 。
五、展望
外泌体冻干技术将极大地促进其药物开发，冻干外泌体保留了生物活性，不需要昂贵的冷链或其他复杂的存储条件。此外，将来需要对含外泌体的核酸（例如miRNA）进行更详细的评估，并探讨冻干对其稳定性的影响。 外泌体-RNA不仅对于细胞反应的传递很重要，而且对于将外泌体用于诊断环境也很重要。评估更详细的冻干外泌体如何与其靶组织相互作用也很重要。
六、参考文献
1, Preservation of small extracellular vesicles for functional analysis and therapeutic applications: acomparative evaluation of storage conditions. Drug Deliv. 2021 Dec;28(1):162-170.
2, Optimizing preservation of extracellular vesicular miRNAs derived from clinical cerebrospinal fluid. Cancer Biomark. 2016 Mar 25;17(2):125-32.
3, Pilot Production of Mesenchymal StemStromal Freeze-Dried Secretome for Cell-Free Regenerative Nanomedicine. Cells. 2018 Oct 30;7(11):190.
4, Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. Int J Pharm. 2018 Dec 20;553(1-2):1-7.
5, Post-production modifications of murine Mesenchymal Stem Cell 1 (mMSC) derived Extracellular Vesicles (EVs) and impact on their cellular interaction. Biomaterials. 2020 Feb;231:119675.
6，Freeze-dried and GMP-compliant pharmaceuticals containing exosomes for acellular mesenchymal stromal cell. Nanomedicine (Lond). 2019 Mar;14(6):753-765.
7, Freeze-Dried Extracellular Vesicles From Adipose-Derived Stem Cells Prevent Hypoxia-Induced Muscle Cell Injury. Front Cell Dev Biol. 2020 Mar 20;8:181.
