外泌体提取纯化试剂盒(细胞上清) 常见问题解答

2021-07-29

1、外泌体提取纯化试剂盒如何保存?

室温保存,无需低温保存。

2、外泌体提取纯化试剂盒能否分离纯化 200-1000nm 直径的囊泡吗?

不能,本试剂盒不能用于直径大于 200nm 囊泡的分离。

3、本试剂盒适用于哪些种类样品中的外泌体提取?

除细胞上清液外,本试剂盒还可用于尿液及其他低密度体液(如脑脊液、腹水、羊水、胸腔积液、唾液等)的外泌体提取。

4、本试剂盒提取过程会用到哪些仪器和耗材?

低温高速离心机、涡旋振荡器(Vortex)、水浴锅、移液器、离心管(1.5mL、50mL)。

5、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存?

可以。长期保存请放置于于-80℃,无须加冻存液;短期保存(1-2 天内)则放置于4℃即可。

6、培养细胞时,如何去除血清来源的外泌体?

多数情况下,细胞在体外培养时需要血清,而血清中一般都含有外泌体,为避免血清对细胞外泌体的污染,可采用以下两种方法:

(1) 将细胞培养用的血清通过 1×105 g 超速离心 10h以上以去除血清外泌体;

(2) 选择无血清完全替代培养基进行细胞培养。《外泌体专用培养基  UR51102

7、无外泌体血清(或者外泌体专用培养基)在什么时候使用?

l  无外泌体血清培养基:

细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后,细胞汇合度约为 60%-70%时,移去原有含血清的培养基,换成新鲜的无外泌体血清培养基,继续培养 24-48h,细胞汇合度达到 80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

l  外泌体专用培养基:

Ø  阶段培养一:待细胞汇合度约为50%时,移去原有完全培养基,添加新培养基(50%外泌体专用无血清培养基+50%完全培养基);

Ø  阶段培养二:待细胞在梯度培养一中生长汇合度约为70-80%时,移去原有的50%外泌体专用无血清培养基+50%完全培养基;

Ø  使用1X PBS溶液将细胞润洗2-3次;

Ø  加入外泌体专用无血清培养基继续培养24-48h,待细胞汇合度到90%-100%时收取细胞培养上清液,该上清液即可用于外泌体提取实验。

8、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取?

会的。在收获细胞时,应确定死亡细胞占比不超过 5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量囊泡,它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体,同时有可能会堵塞 EPF 纯化柱。

9、准备做细胞外泌体 Small RNA 的 NGS 测序,初始样品量需要准备多少?

普通肿瘤细胞系推荐使用 50mL 以上的初始样品量。由于某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低,建议先通过 10kD 超滤柱浓缩(超滤柱上层液体即为浓缩后的样品),准备 50mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

10、加了 ECS 液离心之后无沉淀,这个现象正常吗?

由于某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低,加了 ECS 液离心之后肉眼可能无法观察到沉淀,在重悬时使用 PBS 朝离心管离心外侧的内壁反复吹打洗脱即可(避免剧烈吹打)。针对提取后的外泌体先进行 NTA 粒径检测或 BCA 蛋白定量检测,再决定是否进行后继实验。

11、在纯化过程中,EPF 柱为什么会出现堵塞现象?

l  该现象有可能是因为细胞培养时间过长产生很多细胞碎片(样品离心预处理时不充分,仍有杂质残留。若杂质残留较多,请将上清液转移至新离心管,10000g/20min离心2-3次至无明显沉淀,每次离心收集上清液,建议细胞培养 24-48h 左右收集上清液。

l  PBS重悬的外泌体初始液12000g /2 min离心2-3次至无明显沉淀,每次离心收集上清液,上清液再进行EPF柱纯化。

12、EPF柱是否可以多次使用?

不能重复使用。过量的样品会超出纯化柱的使用极限,影响分离效果。

13、外泌体如何保存?

纯化后的外泌体可于 4℃保存不超过一周,-80℃条件下可长期保存。

14、如何鉴定提取的外泌体?

通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、Western blot 检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行 Western Blot 检测时,通常检测外泌体标志蛋白(CD63、CD9、CD81、TSG101 等)。

《UR52301 外泌体CD63&TSG101蛋白检测试剂盒》

15、提取的外泌体进行 Western Blot 前是否需要加入 RIPA 试剂裂解?

需要,一般按照 1:1 的比例加入RIPA 试剂,或使用《UR33101外泌体专用裂解缓冲液》。

16、进行外泌体 Western blot 鉴定时有无内参蛋白可供选择?

无,该检测属于定性检测。

17、组织细胞外泌体如何提取?

无菌环境下将组织剪成小块(越小越好),然后在无血清的培养基中培养 12h;将培养液转移至离心管中,于 4℃ 3000g 离心 20 min 去除培养液中杂质和细胞碎片,将上清液转移至新的离心管中;先使用 0.45μm 滤器过滤上清液,接着使用 0.22μm 滤器过滤上清液,再按照本试剂盒说明书提取外泌体。