粪便外泌体提取方法

2022-04-06

实验目的:从粪便中分离提取外泌体。

实验原料:粪便(新鲜或者4℃存储样品)


试剂耗材:

1,外泌体提取试剂盒(Umibio,UR52121)

2,针式过滤器(0.45µm)

3,PBS缓冲液(2℃-8℃预冷)


实验步骤:

  • 样品预处理

(1)粪便样本收集在无菌的宽口容器中,立即使用(收集样品后置于冰上)或冷藏(4°C)。

(2)使用勺子将3g的粪便转移到预先称重的离心管中,向试管中加入预冷(2℃-8℃)的30毫升无内毒素PBS(按照每1g粪便对应10毫升PBS加入)。

(3)通过涡旋振荡器充分混匀粪便样本5分钟。在此步骤中,将高速离心机和离心转子冷却至4°C。

(4)将混匀粪便的离心管放入高速离心机中,在4°C,8000g的温度下离心10分钟。

(5)收集滤过液,使用移液器将其转移到新的离心管中,在4°C,10000g的温度下离心10分钟。

(6)收集滤过液,通过针式过滤器(0.45µm)进行过滤,收集滤过液。


  • 提取外泌体

(1)滤过液预处理:在去除杂质的离心滤过液中加入Exosome Concentration Solution(ECS试剂),具体的加入剂量如下:(其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算)

样品名称

样品剂量

加入ECS剂量

粪便滤过液

20 mL

5 mL

(2)溶液混合:加入ECS试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀1 min,再放置于4℃静置至少2 h;(增加静置时间可提高外泌体得率,但静置时间不可超过24h)

(3)沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;(注:尽可能吸净滤过液)

(4)外泌体重悬:取1×PBS均匀吹打离心沉淀物(具体加入剂量如下表),待其溶解后,将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中;

样品体积

加入PBS剂量

20 mL

0.2 mL

注:其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

(5)收获外泌体颗粒:将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心2 min,保留滤过液,该滤过液中富含外泌体颗粒。(注:若沉淀较多,可12000 g /2min离心多次至无明显沉淀,每次取离心滤过液)


  • 纯化外泌体

(1)纯化外泌体:将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter(EPF柱)上室中,于4℃以3000g离心10 min,离心后收集EPF柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒;(注:EPF柱不可重复使用)

(2)外泌体的保存:纯化后的外泌体以50-100 μL进行分装保存于-80℃低温冰箱中,以备后继实验使用。

 

参考文献:

1 Isolation and Characterization ofExosomes from Mouse Feces, Bio Protoc. 2020 Apr 20;10(8):e3584. doi:10.21769/bioprotoc.3584.

2 High-fat diet-induced upregulation ofexosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nat Commun.2021 Jan 11;12(1):213. doi: 10.1038/s41467-020-20500-w.

3  Sepsis-Like Systemic InflammationInduced by Nano-Sized Extracellular Vesicles From Feces. Front Microbiol. 2018Aug 7;9:1735. doi: 10.3389/fmicb.2018.01735. eCollection 2018.