FAQ(常见问题)

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  • 商品介绍
  • 规格参数
  • 1、本试剂盒如何保存?


            室温保存,无需低温保存。


    2、本试本剂盒能否分离纯化200-1000nm直径的囊泡吗?


            不能,本试剂盒不能用于直径大于200nm囊泡的分离。


    3、本试剂盒适用于哪些种类样品中的外泌体提取?


            除细胞上清液外,本试剂盒还可用于尿液及其他低密度体液(如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等)的外泌体提取。


    4、本试剂盒提取过程会用到哪些仪器和耗材?


            低温高速离心机、涡旋振荡器(Vortex)、水浴锅、移液器、离心管(1.5mL、50mL)。


    5、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存?


         可以。长期请保存于-80℃,无须加冻存液;短期(1-2天内)则保存于4℃即可。


    6、粘度过大的样品如何处理?


            如果样品粘度过大时(因细胞分泌物较多所致),可将样品用1×PBS缓冲液进行等体积稀释,混匀稀释后的样品再使用本试剂盒提取外泌体。


    7、培养细胞时,如何去除血清来源的外泌体?


            多数情况下,细胞在体外培时养需要血清,而血清中一般都含有外泌体,为避免血清对细胞外泌体的污染,可采用以下两种方法:


    (1)      将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h以去除血清外泌体;


    (2)      选择无血清培养基进行细胞培养。


    8、无外泌体血清培养基(或者无血清培养基)在什么时候使用?


            细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后,细胞融合度约为60%-70%时,移去原有含血清的培养基,换成新鲜的无外泌体血清培养基(或者无血清培养基),继续培养24-48h,细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

     

    9、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取?


            会的。在收获细胞时,应确定死亡细胞占比不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡,它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体,同时有可能会堵塞EPF纯化柱。


    10、准备做细胞外泌体Small RNA的NGS测序,初始样品量需要准备多少?


            普通肿瘤细胞系推荐使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低,建议先通过10kD超滤柱浓缩,准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。


    11、加了ECS液离心之后无沉淀,这个现象正常吗?


            由于某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低,加了ECS液离心之后肉眼可能无法观察到沉淀,在重悬时使用PBS液朝离心管离心外侧的内壁反复吹打洗脱即可(避免剧烈吹打)。针对提取后的外泌体先进行NTA粒径检测或BCA蛋白定量检测,再决定是否进行后继实验。


    12、在纯化过程中,EPF柱为什么会出现堵塞现象?


          该现象有可能是因为细胞培养时间过长产生很多细胞碎片(样品离心预处理时不充分,仍有细胞碎片残留),建议细胞培养24-48h左右收集上清液。


    13、EPF柱是否可以多次使用?


            不能重复使用。过量的样品会超出纯化柱的使用极限,影响分离效果。


    14、外泌体如何保存?


            纯化后的外泌体可于4℃保存不超过一周,-80℃条件下可长期保存。


    15、如何鉴定提取的外泌体?


            通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行Western blot检测时,通常检测外泌体标志蛋白(CD63、CD9、CD81、TSG101等)。


    16、提取的外泌体进行Western blot前是否需要加入RIPA试剂裂解?


            需要,一般按照1:1的比例加入RIPA试剂。


    17、进行外泌体Western blot鉴定时有无内参蛋白可供选择?


            无,该检测属于定性检测。      

     

    18、组织细胞外泌体如何提取?


            无菌环境下将组织剪成小块(越小越好),然后在无血清的培养基中培养12h;将培养液转移至离心管中,于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片,将上清液转移至新的离心管中;先使用0.45μm滤器过滤上清液,接着使用0.2μm滤器过滤上清液,再按照本试剂盒说明书提取外泌体。