细胞功能检测

可以解决编码和非编码基因在肿瘤细胞模型上的基因功能研究,研究方向包括肿瘤细胞增殖,转移,侵袭等方向。

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  • 细胞功能检测可以解决编码和非编码基因在肿瘤等细胞模型上的基因功能研究,研究方向包括肿瘤细胞增殖,转移,侵袭等方向。


    CCK-8检测


    一、实验原理


    Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。


    二、实验流程


    1、制备细胞悬液:细胞计数。


    2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。


    3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。


    4、加入10ul CCK-8:由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK-8的培养基,以换液的形式加入。


    5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。


    6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。


    细胞凋亡检测


    一、实验原理


    细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。将Annexin V 进行荧光素标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


    二、实验流程


    1、细胞收集;2、细胞洗涤;3、细胞标记;4、流式细胞仪分析;5、结果判断。


    克隆形成能力检测


    一、实验原理


    克隆指单个细胞在体外持续分裂增殖6代以上,其后代所组成的细胞群。光镜下,大于50个细胞,计数为1个克隆。细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁写的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞。


    二、实验流程


    1.平板克隆形成试验:适用于贴壁型细胞,如正常细胞或肿瘤细胞;控制细胞迁移。


    (1) 取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。


    (2) 将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力) 接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周。


    (3) 经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS 小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15分钟。然后去固定液,加适量Giemsa 应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。


    (4) 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜) 计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。


    2. 软琼脂克隆形成试验:适用于肿瘤细胞、转化细胞和悬浮生长细胞;无细胞迁移;底层为0.5%琼脂,上层为0.3%琼脂(含细胞)。


    (1) 取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM 培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。


    (2) 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固。


    (3) 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM 培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清) 混合后,取3mL 混合液注入直径6cm 平皿中(10cm平皿加7~10mL) ,冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。


    (4) 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM 培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL 的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10~14天。


    (5) 把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm 的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

    Transwell检测


    一、实验原理


    Transwell 是一项实验技术,主要材料是Transwell小室,外形为一个可放置在孔板里的小杯子,那就是杯子底层的一张有通透性的膜而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔孔径大小有0.1-12.0µm,根据不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜。Tanswell小室放在培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装有上层培养液,下室内盛装下层培养液,将细胞接种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。


    应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。细胞侵袭需要使用基质胶。


    二、实验分类


    1. 共培养体系:小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0um以下孔径。将细胞A接种于上室,细胞B接种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。


    2. 趋化性实验:可用5.0,8.0,12.0um膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。A 细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A 的趋化作用。B 趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。


    3. 肿瘤细胞迁移实验:常用8.0,12.0um膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向影响成分高的下室跑。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。