真香！用 qPCR 做外泌体研究，南京医科大学拿下 41 分 SCI

外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行

qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈？

实验过程：

包括 Umibio 在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒。样本预处理阶段很重要，甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。详细操作注意可以点击上期文章链接了解：外泌体实验 bug 多，靠这个方法我提前完成了课题！

外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀）。

具体操作：取 200 μl 外泌体于 1.5 ml EP 管中，加入 800 μl Trizol 试剂，充分混合，裂解 10 min，12000 rpm 离心 10 min 取上清。

采用 Umibio 4× 预混型快速逆转录试剂盒：适用于长片段 RNA（如 mRNA、LncRNA 等）、miRNA 加尾法逆转录试剂盒做反转录：适用于短片段 RNA（主要为 miRNA）的加尾法。

采用 Umibio 2×SYBR Green qPCR 试剂：预混 ROX1 型适用于 ABI 5700 等设备、预混 ROX2 型适用于 ABI 7500 等设备。

可以看到 qPCR 检测外泌体可行且可靠，但实验过程并不简单，因此我们对经常会遇到的问题及解答也进行了整理，帮助大家更好的完成实验。

qPCR检测外泌常见问题及解决方法

外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀）。

外泌体 RNA 含量很低，不建议使用微量紫外分光光度计定量，可以使用 Agilent 2100 生物分析仪等定量，也可以直接按最大体积进行逆转录实验。

外泌体没有通用的内参选择，可以使用外参（cel-miR-39）作为参照。

一般来说属于正常现象，由于外泌体不像细胞或者组织来源稳定，不同外泌体样本及处理的差异，可能导致外泌体里核酸含量及片段大小不同，会产生扩增曲线或溶解曲线的差异。

属于正常现象，由于外泌体 RNA 含量较低，特别是一些低丰度的基因 CT 值会较大，可以选择高效的反转录及 PCR 试剂。

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qPCR 检测外泌体实验中相关产品

4× 预混型快速逆转录试剂盒

本试剂盒采用的 DNase 及 buffer 反应系统经过特殊的优化，仅需室温（19～27℃）反应 5 分钟，就能降解 95% 以上的基因组 DNA，极大地降低了残留基因组对结果的干扰。

新型 M-MLV 突变体逆转录酶具有很强的抗干扰能力及扩增能力，15 分钟得到的扩增产物量可以达到 AMV 逆转录酶大约 1 小时的产物量（Ct 值相同）。后续逆转录产物建议用于 PCR、qPCR，不建议用于基因克隆。

miRNA 加尾法逆转录试剂盒

本试剂盒采用 Poly(A)加尾反应和 cDNA 合成反应同步进行的方法来进行 microRNA 第一链 cDNA 的合成，包含了与此配套的通用型 qPCR 反向引物（Universal 3’qPCR Primer），仅需自行设计一条目的 microRNA 的特异性正向引物，就能够用于 microRNA 的定量检测。

2×SYBR Green qPCR 试剂（预混 ROX1 型或预混 ROX2 型）

本试剂盒采用具有超强扩增能力和抗干扰能力的热启动 DNA 聚合酶，结合其高度优化的缓冲液体系和染料系统，使之具备更强的扩增效率、抗干扰能力，更高的灵敏度和特异性。在相同的情况下具有起峰更早、得到的荧光信号更强、Ct 值更小及熔解曲线特异性更高等特点。此外，为了进一步简化操作，本试剂盒的 2×SYBR Green qPCR Master Mix 预混了 ROX1 染料（highROX）或预混了 ROX2 染料（low ROX），从而只需要将模板 cDNA、引物以及 ddH2O 添加进去，即可进行 qPCR 反应。